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PCR扩增产物的克隆TA克隆法69677创富高手论坛资料

更新时间: 2019-10-07

  实验方法原理TA克隆 系统由Invitrogen公司(San Diego,CA)发展而来的商业性试剂盒,它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点(MCS)中。

  外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

  T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底,可对载体进行5除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DNA断的3OH末端与5端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

  连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。69677创富高手论坛资料,但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

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  3. 将离心管转入42℃水浴,热冲击90秒,然后不要摇动离心管,迅速将其放在冰上2 min。

  (2) 用经灭菌的10 ul 枪头(不用牙签)挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中。

  (4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温,离心数秒,然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。

  (5) 按以下条件进行PCR反应:94℃预变性3 min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94℃变性1 min,57℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;循环结束后72℃再延伸5 min。

  (1)用离心管收集4 ml在LB培养基(含Amp)中培养过夜的菌液,14 000 rpm离心30秒,弃尽上清。

  (3)加入250 ul Buffer S2,温和但充分地上下翻转混合4-6次,此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH,降低溶菌效率。

  *若离心后凝结块未沉淀到离心管底部,应再上下翻转数次,12000g离心3min。

  2. 抽提纯化质粒DNA酚、抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。

  (2)加等体积的酚::异戊醇(25:24:1),震荡混匀,静置3 min。

  (5) 14 000rpm离心5 min,吸上清液,加2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀后-20℃放置15 min,沉淀质粒DNA。

  (6) 14 000rpm离心13 min,弃上清液,沉淀加入200 uL 70%乙醇洗涤一次,室温干燥,用20 uL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀,-20℃保存待用。

  (2)PCR 扩增反应条件:94℃预变性3 min;然后进行30 个循环反应,其温度循环条件为:

  (3) 取5 ul PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,方法与试验二相同。

  4. 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作,同时注意近火无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染。

  6. 菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。

  10. 克隆时使用的Insert DNA段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化,PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

  11. 按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。

  12. 连接反应请在16℃下进行,温度升高 (26℃) 较难形成环状DNA。

  14. 感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞,如:JM109,DH5a等。

  (3)DNA段的立体结构、DNA段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)小于短片段DNA,在使用大片段DNA的连接液进行转化时,建议采用电转化方法。

  (1)确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3端是否附加了A。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆;PCR产物保存时间不要过长,长时间保存的PCR产物会脱去末端的A碱基。

  (2)PCR产物中短片段杂质DNA太多,这时应切胶回收纯化DNA段,回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。

  (3)确认感受态细胞的转化效率,使用的感受态细胞的转化效率大于108 cfu/mg pUC118 DNA。

  插入的PCR片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响lacZ基因的读框时,平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。

  本制品的载体来源于pUC18载体。因此,用于pUC18载体测序的引物都可以使用。

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